《四川动物》

文章标题:应用2A肽策略构建双基因共表达转基因斑马鱼的研究

文章作者:张力1, 刘超1, 周昕2, 谢英1, 刘树锋1*
关 键 字:2A肽;斑马鱼;双顺反子
文章摘要:目的 以Tol2为骨架载体,以绿色荧光蛋白(GFP)、Cherry为报告基因,探讨采用2A肽双基因载体构建策略构建单启动子双基因共表达质粒的方法;将B细胞刺激因子(BAFF)分别置于2A序列前后位置,分析位置效应对跨膜融合蛋白的表达与剪切的影响,探讨多基因共表达转基因斑马鱼构建技术.方法 以InFusion法将GFP-2A-Cherry序列构建到Tol2质粒上,所得pTol-GFP-2A-Cherry质粒转染HeLa细胞、显微注射1-细胞期斑马鱼受精卵;倒置荧光显微镜观察HeLa细胞、斑马鱼幼鱼体内GFP与Cherry蛋白的表达,Western blot法验证GFP和Cherry蛋白的表达量与剪切情况;分别构建pTol2-GFP-2A-BAFF与pTol2-BAFF-2A-Cherry质粒,Western blot法检查BAFF的表达与剪切情况.结果 pTol2-GFP-2A-Cherry质粒转染的HeLa细胞,GFP与Cherry均可单独表达且表达呈现时空一致性;GFP-2A-Cherry融合蛋白可被剪切为GFP与Cherry,且成等比例表达趋势.pTol2-GFP-2A-Cherry质粒显微注射1-细胞期斑马鱼受精卵可获得可单独表达GFP与Cherry蛋白的转基因斑马鱼;pTol2-GFP-2A-BAFF与pTol2-BAFF-2A-Cherry于斑马鱼体内均有融合蛋白的表达,且BAFF序列位于2A序列后更易于融合蛋白的剪切.结论 通过2A肽策略构建可实现在斑马鱼体内单一载体、单一启动子调控双基因表达目的.发现编码跨膜分泌蛋白的功能基因位于2A序列的不同位置会直接影响蛋白的剪切,功能基因位于2A序列后易于跨膜蛋白的剪切.